Diagnóstico de la seguridad alimentaria Kit de detección de ELISA para el diazepam Pruebas de residuos de fármacos veterinarios

el kit de pruebas ELISA para el diazepam

No de catálogo LSY-10021

1Principio.

Este kit de ensayo se basa en el ensayo inmunológico enzimático competitivo para la detección del diazepam en los piensos, la orina, el hígado y la carne.El diazepam en la muestra y el antígeno de acoplamiento pre-revestido en las franjas del micro-pozo compiten por los anticuerpos del diazepam.Después de la adición del conjugado enzimático, se añade el sustrato TMB para la coloración. El valor de la densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con el diazepam que contiene.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de diazepam..

2Especificaciones técnicas

Sensibilidad:0.1 ppb

Límites de detección

Tejido 1 ppb

1 ppb de orina

Alimentación para animales 10 ppb

Tasa de recuperación

Orina 80 ± 10%

Alimentación 75 ± 10%

Tejido (carne, hígado) 85 ± 10%

Tasa de reacciones cruzadas

el diazepam 100%

el nitrazépamo 7,6%

Oxazepam 8.8%

3. Componentes

• Las bandas de micro-pozo: 12 bandas con 8 pozos extraíbles cada una
• 6 veces la solución estándar (1 ml cada una): 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb
• Conjugado de enzimas (12 ml) con tapa roja
• Solución de trabajo de anticuerpos (7 ml) tapa azul
• Substrato solución A (7 ml) con tapa blanca
• Solución de sustrato B (7 ml) con tapa negra
• Solución de parada (7 ml) tapa amarilla
• 20× tampón blanco de tampón de lavado concentrado (40 ml)
• 2× solución de redisolución concentrada (50 ml) con tapa transparente

4- Materiales requeridos pero no proporcionados

• Equipamiento:Lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, votex, centrífuga, pipetas de medición, balanza (con una sensibilidad recíproca de 0,01 g).
• Los micropipetadores:de un solo canal de 20 a 100 μL y de 200 a 1000 μL, y de varios canales de 250 μL.
• Los reactivos:N-hexano, NaOH, diclorometano y CH₂C.L.₂), CH₃El CN.

5Pre-tratamiento de la muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben tratarse antes del pretratamiento)

• Sólo se podrán utilizar las puntas desechables para los experimentos y las puntas deberán cambiarse cuando se utilicen para absorber diferentes reactivos.
• Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y, si es necesario, debe volver a limpiarse, a fin de evitar la contaminación que interfiera con los resultados del experimento.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

• 0.1 M NaOH: se disuelven 0,4 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada.
• 1 M NaOH: se disuelven 4 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada.
• 2 M NaOH: disolver 8 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada.
• La solución de redisolución concentrada 2× se mezcla con agua desionizada a 1:1 (1 ml de solución de redisolución concentrada + 1 ml de agua desionizada), utilizada para la redisolución de la muestra tratada.

5) N-hexano-CH₂C.L.₂Solución: V_N-hexano:Ⅴ_{El CH2Cl2}= 5:3.

5.1 Tejidos animales(carne, hígado)

• Se tomará la muestra, se homogeneizará a 10000 r/min durante 1 min.
• Pesar 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada, colocarla en un tubo centrífugo de 50 ml, añadir 5 ml de CH₃CN,1 mL 2 M NaOH, agitar adecuadamente durante 10 min, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a 10 °C durante 10 min,
• Tomar 3 ml de supernatante (capa superior) en un nuevo tubo centrífugo, añadir 200 μL de 2 M NaOH, 6 ml de N-hexano-CH₂C.L.₂solución, agitar durante 10 minutos y centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min a 20-25 °C durante 5 minutos,
• Estático durante 5 a 10 minutos, transferir todo el supernatante a un nuevo tubo centrífugo, soplar para secar con nitrógeno,
• Residuos diluidos en 1 ml de la solución de redisolución diluida,
• Se tomará la solución de muestra, diluida a 1:9 (50 μL de solución de muestra + 450 μL de solución redisolvente diluida),
• Tomar 50 μL para su posterior análisis.

Doble de dilución de la muestra: 10 Límites de detección: 1 ppb

5.2 Orina

• Colocar 1 ml de muestra clara en un tubo centrífugo de 50 ml, añadir 4 ml de 0,1 M NaOH, agitar adecuadamente durante 2-5 min.
• Trasferir 1 ml de líquido a otro tubo centrífugo, añadir 10 ml de N-hexano, agitar durante 5 minutos y centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min a 20-25 °C durante 5 minutos.
• Transferir 5 ml de supernatante a un nuevo tubo centrífugo, soplar para secarlo con nitrógeno,
• Diluir con 1 ml de la solución redisolvente diluida.
• Tomar 50 μL para su posterior análisis.

Doble de dilución de la muestra: 10 Límites de detección: 1 ppm

5.3 Alimentos para animales

• Colocar 1,0 ± 0,05 g de alimentación en un tubo centrífugo de 50 ml, añadir 6 ml de agua desionizada y 1 ml de 1 M NaOH, girar durante 1 minuto, añadir 6 ml de N-hexano-CH₂C.L.₂solución ((5:3), agitar adecuadamente durante 10 min, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a temperatura ambiente durante 5 min,
• Se toman 3 ml de supernatante (capa superior), se soplan para secar con nitrógeno a 50 °C,
• Diluir con 1 ml de la solución redisolvente diluida.
• Dilución: a 1:49 ((10 μL de muestra + 490 μL de la solución redisolvente diluida)).
• Tomar 50 μL para su posterior análisis

Doble de dilución de la muestra: 100 Límites de detección: 10 Pb y p

Aviso: Recomendamos el estándar 3 como cortado debido a alguna interferencia.

6Procedimientos de ELISA

6.1 Instrucciones

• Antes de su uso, llevar todos los reactivos y las tiras de micro-pozo a temperatura ambiente (20-25 °C).
• Devolver todos los reactivos a 2-8 °C inmediatamente después de su uso.
• La reproductibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de platos, siendo el correcto funcionamiento del lavado de platos el punto clave de los procedimientos de ELISA.
• Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada por la membrana de cubierta.

6.2 Procedimientos de funcionamiento

• Sacar el kit del ambiente refrigerado, sacar todos los reactivos necesarios del kit y colocarlos a temperatura ambiente (20-25 °C) durante al menos 30 minutos.Tenga en cuenta que cada reactivo líquido debe agitarse para mezclarse uniformemente antes de su uso..
• Tomar las tiras de micro-pozo y los marcos de placas requeridos.
• Preparación de la solución: diluir el tampón de lavado concentrado 20× con agua destilada o desionizada hasta 800 ml (o sólo hasta el volumen requerido) para su uso.
• Numeración: se numeran los micro-pozos según las muestras y la solución estándar; cada muestra y solución estándar deben realizarse en duplicado; se registran sus posiciones.
• Añadir 50 μL de la muestra o solución estándar a los pozos duplicados separados, añadir 50 μL de la solución de trabajo de anticuerpos en cada pozos.y incubar a 37 °C durante 30 minutos.
• Verter líquido de mirowell, añadir 250 μL/pozo de amortiguador de lavado durante 10 segundos, repetir cuatro a cinco veces.cortarlos con las puntas limpias).
• Añadir 100 μL de enzima conjugada a cada pozo, sellar la microplaca con la membrana de cubierta, incubar a 37 °C durante 30 minutos, continuar como se describe en el punto 6.
• Coloración: añadir 50 μL de solución de sustrato A y 50 μL de solución de B en cada pozo. Mezclar suavemente sacudiendo la placa manualmente.sellar la microplaca con la membrana de la cubierta e incubar a 37 °C durante 15 minutos en la oscuridad para obtener la coloración..
• Determinación: añadir 50 μL de solución de parada en cada pozo. Mezclar suavemente sacudiendo la placa manualmente.Establecer la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD (se recomienda leer el valor de OD a la doble longitud de onda 450/630 nm en un plazo de 5 min)

7. Juicio del resultado

Existen varios métodos para juzgar los resultados; el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Hay que tener en cuenta que el valor de la DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de diazepam en la muestra..

7.1 Determinación cualitativa

El intervalo de concentración (ng/mL) se puede obtener mediante la comparación del valor medio de la DO

El valor OD de la muestra I es 0.211, y el de la muestra II es 0.785, el valor OD de las solutinas estándar es: 2,100 para 0 ppb, 1,580 para 0,1 ppb, 1,010 para 0,3 ppb, 0,580 para 0,9 ppb, 0,308 para 2,7 ppb, 0,120 para 8,1 ppb,en consecuencia, el rango de concentración de la muestra I es de 2de 0,7 a 8,1 ppb, y la muestra II es de 0,3 a 0,9 ppb (multiplicado por el doble de dilución correspondiente)

7.2 Cuantitativo determinación

The mean values of the absorbance values obtained for the average OD value (B) of the sample and the standard solution divided by the OD value (B0) of the first standard solution (0 standard) and subsequently multiplied by 100%, es decir,

B­el valor medio de OD de la muestra o de la solución estándar

B. El trabajo₀¢el valor medio de la DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de las solutinas estándar y los valores del semilogaritmo de las solutinas estándar de diazepam (ng/mL) como eje Y y eje X, respectivamente.Se leerá la concentración correspondiente de la muestra a partir de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándarEl valor resultante se multiplica posteriormente por el doble de dilución correspondiente, obteniendo así finalmente la concentración de diazepam en la muestra.

El uso del software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis preciso y rápido de una gran cantidad de muestras.

8Las precauciones

• La temperatura ambiente inferior a 20 °C o la temperatura de los reactivos y las muestras que no vuelvan a la temperatura ambiente (20-25 °C) darán lugar a un valor estándar de DO inferior.
• La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado se verá acompañada de situaciones como las curvas estándar no lineales y la reproductibilidad indeseable.Así que continúa con el siguiente paso inmediatamente después de lavar.
• Mezclar uniformemente, de lo contrario habrá la reproductibilidad indeseable.
• La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evitar el contacto con la piel.
• El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits dará lugar a cambios en la sensibilidad y en los valores de detección de la DO.No se intercambien los reactivos de los kits de diferentes números de lotes para su uso.
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa de sellado automático para volver a sellarla.
• El valor de detección de la solutina estándar 0 es inferior a 0,5 (A450 nm< 0.5) indica su degeneración.
• El tiempo de coloración es de unos 15 minutos, si el color es claro, prolongar el tiempo de coloración pero no exceder los 30 minutos.
• La temperatura de reacción óptima es de 25 °C, y temperaturas demasiado altas o bajas darán lugar a cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad

El almacenamiento:almacenar a 2-8 °C, no congelado.

Fecha de caducidad:12 meses; la fecha de producción está en la caja.