Inmunoensayo enzimático del equipo de detección ELISA del Beta-agonista de diagnóstico de seguridad del cerdo LSY-10036

β-agonistasKit de prueba ELISA

N.º de catálogo LSY-10036

1. Principio

La primavera verde^®El kit de prueba de agonistas β se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo para la detección de agonistas β en la muestra.El antígeno de acoplamiento está recubierto previamente sobre las tiras de los micropocillos.Los agonistas β de la muestra y los antígenos de acoplamiento recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos compiten por los anticuerpos anti-agonistas β.Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración.El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con los β-agonistas de la muestra.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtienen los residuos de los β-agonistas.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0.1ppb

Temperatura de incubación: 25 ℃

Tiempo de incubación: 30 minutos~15 minutos

Límite de detección:

Orina porcina 0.3ppb

Cerdo 0.6ppb

Tasa de reacción cruzada:

Clenbuterol 100%

Cimaterol <4%

Brombuterol 60%

Mabuterol 108%

Bambuterol <5%

Clorprenalina <1%

Salbutamol 75%

Terbutalina 25%

Penbutolol 19%

tulobuterol 23%

Fenoterol <0,1%

Ractomina <0,1%

Índice de recuperación:

Orina porcina, cerdo 90%±30%

3.Componentes

4. Materiales necesarios pero no proporcionados

• Equipos:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, vórtice, oscilador, centrífuga, incubadora, pipetas medidoras, balanza (una sensibilidad recíproca de 0,01 g)
• Micropipetas:monocanal de 20 a 200 µl, de 100 a 1000 µl y multicanal de 30 a 300 µl;
• Reactivos:NaOH, HCl.

5. Pretratamiento de muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben abordarse antes del pretratamiento)

• Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
• Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar la contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

• HCl 0,2 M: disuelva 17,2 ml de HCl en agua desionizada hasta obtener 1 litro.
• NaOH 1 M: disolver 4 g de NaOH en agua desionizada hasta 100 ml.

3) Solución de extracción de muestras: 1 parte de solución de extracción de muestras 5X + 4 partes de agua desionizada, mezclar uniformemente.

5.1 Porcino urino

Tomar 20 µL de orina clara, detectarla directamente (si la orina está turbia, debe filtrarse o centrifugarse a 4000 r/min durante 10 min, luego tomar orina clara).Guárdelo en un ambiente congelado si no lo usa.

Pliegue de dilución de la muestra:1

5.2 Cerdo

• Pesar 2 ± 0,05 g de muestra de tejido homogeneizado en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 3 ml de HCl 0,2 M y agitar durante 3 minutos.
• Luego agregue 600 ul de solución de NaOH 1 M y 2,4 ml de solución de extracción de muestra, agite durante 3 minutos, centrifugue a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min.
• Tome 20 µL de líquido de la capa superior para el análisis. (Nota: si hay una capa de grasa después de la centrífuga, retire la capa de grasa o separe la capa de grasa, tome un líquido transparente para el análisis).

Pliegue de dilución de la muestra:4

6.Procedimientos ELISA

6.1Instrucciones

• Lleve todos los reactivos y las tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de su uso;
• Devuelva todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;
• La reproducibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de la placa.El correcto funcionamiento del lavado de placas es el punto clave en los procedimientos ELISA;
• Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada con la membrana protectora.

6.2Operaciónprocedimientos

• Lleve el kit de prueba a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos; tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse uniformemente antes de usarlo;
• Coloque las tiras de micropocillos necesarias en marcos de placas.Se volvió a sellar la microplaca no utilizada, se almacenó a 2-8 ℃, no se congeló.
• Diluir los 40 ml de tampón de lavado concentrado 20X a 1:19 con agua desionizada (1 parte de tampón de lavado concentrado 20X + 19 partes de agua desionizada).O prepárelo según la cantidad necesaria.
• Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar;cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado;registrar sus posiciones.
• Agregue 20 µL de la muestra o la solución estándar en pocillos duplicados separados, luego agregue el conjugado enzimático, 50 µL/pocillo;luego agregue la solución de trabajo de anticuerpos, 80 µl/pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente, sellar la microplaca con la membrana de cobertura,incubar a 25 ℃ durante 30 min.
• Vierta el líquido del micropocillo, agregue 250 µl/pocillo de tampón de lavado, lave de 4 a 5 veces, de 15 a 30 segundos cada vez, luego retírelo y agátelo para secarlo con papel absorbente (si quedan burbujas después de aletear, córtelas con el puntas limpias).
• Coloración: agregue 50 µL de sustrato A, luego agregue 50 µL de sustrato B en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente,e incubar a 25 ℃ durante 15 minen eloscuro para la coloración.
• Determinación: añadir 50 µL de la solución de parada en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente.Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD de cada pocillo.(Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7.Juicio de resultado

Hay dos métodos para juzgar los resultados;el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con la concentración de agonistas β en la muestra.

7.1 Determinación cualitativa

El rango de concentración (ng/mL) obtenido al comparar el valor de DO promedio de la muestra con el de la solución estándar.Suponiendo que el valor de DO de la muestra Ⅰ es 0,3 y el de la muestra Ⅱ es 1,0, el valor de DO de las soluciones estándar es: 2,243 para 0 ppb, 1,816 para 0,1 ppb, 1,415 para 0,3 ppb, 0,74 para 0,9 ppb, 0,313 para 2,7 ppb, 0,155 para 8,1 ppb; en consecuencia, el rango de concentración de la muestra Ⅰ es de 2,7 a 8,1 ppb y el de la muestra Ⅱ es de 0,3 a 0,9 ppb.

7.2Cuantitativo determinación

Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para el valor OD promedio (B) de la muestra y la solución estándar divididos por el valor OD (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente se multiplica por 100%, es decir

B: el valor de DO promedio (pocillos dobles) de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores de semilogaritmo de las soluciones estándar de agonistas β (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente.Lea la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.El valor resultante se multiplica posteriormente por el factor de dilución, obteniendo finalmente la concentración de β-agonistas en la muestra.

8.Precauciones

1.La temperatura ambiente inferior a 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.

2. La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada;Continúe con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.

3. Mezcle uniformemente, de lo contrario habrá una reproducibilidad no deseada.

4.La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel.

• No utilice el kit superando su fecha de caducidad.El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO.No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote a utilizar.
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla.La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
• Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.El valor de detección de la solución estándar 0 (0 ppb) inferior a 0,5 indica su degeneración.
• La temperatura de reacción óptima es 25 ℃, y temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad.

Almacenamiento:almacenar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad:12 meses;la fecha de producción está en la caja.

Observaciones: Si el paquete al vacío de las placas de microtitulación tiene fugas, la placa de microtitulación es normal y efectiva, no afecta el resultado experimental.Siéntase libre de utilizarlo.