LSY-10010 Kit de ensayo ELISA de sulfametazina (SM2) de diagnóstico alimentario

Sulfametasina (SM2)Equipo ELISA

N.º de catálogo LSY-10010

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo indirecto para la detección de residuos de sulfametazina (SM2).Los antígenos de acoplamiento están recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos.La sulfametazina de la muestra y los antígenos de acoplamiento recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos compiten por los anticuerpos anti-sulfametazina.Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración.El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con la sulfametazina en la muestra.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de Sulfametasina.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad:1ppb

Temperatura de la incubadora:25 ℃

Tiempo de incubadora:30min~15mín.

Límite de detección

Tejido (método de límite de detección alto) 1 ppb

Tejido (método de límite de detección inferior)……………………………………...5 ppb

Miel, huevo 1 ppb

Suero, orina 4 ppb

Leche 20 ppb

Tasa de reacción cruzada

Sulfametasina(SM2)………………………………………………………….100%

Índice de recuperación

Tejido, orina, leche 85±25%

Miel, suero, huevo 80±23%

3.Componentes

4. Materiales necesarios pero no proporcionados

• Equipos:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, votex, centrífuga, pipetas medidoras, balanza (una sensibilidad recíproca de 0,01 g), incubadora
• Micropipetas:monocanal 20-200 µL, 100-1000 µL y multicanal 30-300 µL;
• Reactivos:Acetonitrilo (CH₃CN), acetato de etilo, N-hexano, K₂HPO₄·12H₂O, monohidrato de ácido cítrico (C₆h₈oh₇·H₂O), HCl, NaOH, CH₂CL_2,

5. Pretratamiento de muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben abordarse antes del pretratamiento)

• Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
• Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar la contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

• Solución de NaOH 0,2 M: Pesar 0,8 g de NaOH, disolver con 100 ml de agua desionizada;
• HCl 0,5 M: Tome 4,3 ml de HCl, disuélvalos con agua desionizada hasta 100 ml, mezcle uniformemente;
• N / A₂HPO₄- C₆h₈oh₇·H₂Tampón de O: pesa 19,85 gNa₂HPO₄·12H₂O y 9,3 g de C₆h₈oh₇·H₂O, disolver con agua desionizada hasta 1 litro, mezclar uniformemente;
• CH₃CN-CH₂CL₂solución: V_CH3CN:v_CH2Cl2=1:4;
• La solución de redisolución concentrada 20X se diluye con agua desionizada a 1:19 (1 parte de solución de redisolución concentrada + 19 partes de agua desionizada).

5.1Tejido

A. Método de límite de detección alto

Método uno

1) Pesar 2,0 ± 0,05 g de la muestra de tejido homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 6 ml de acetato de etilo, agitar durante 2 min, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 min;

2) Tome 3 ml de la fase orgánica clara en un recipiente seco, sople para secar completamente con nitrógeno o aire mediante evaporación rotatoria a 50-60 ℃

• Disolver los residuos secos en 1 ml de la solución redisoludora diluida, agregar 1 ml de N-hexano, mezclar durante 30 segundos;Centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 5 min.Retire la fase N-hexano de la capa superior,
• Tome una solución de 50 µl de capa inferior para realizar más análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:1

Método dos(para tejido y huevo)

• Pesar 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada y colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml;
• Añadir 8 ml de CH₃CN-CH₂CL₂solución, agitar durante 5 min, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 min;
• Transfiera 4 ml de fase orgánica a un recipiente seco, sople para secar con nitrógeno o aire completamente mediante evaporación rotatoria a 56 ℃
• Agregue 1 ml de la solución diluida de redisolución para redisolver el residuo seco, agregue 1 ml de N-hexano y agite durante 30 segundos.Centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 5 min;
• Retire la fase N-hexano de la capa superior.Tome 50 l de solución de capa inferior para realizar más análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:1

B. Método de límite inferior de detección de tejido

1) Pesar 2,0 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 8 ml de solución redisoludora diluida, agitar durante 2 min, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 min;

2) Tome 50 µL de solución para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:5

5.2 suero

1) Coloque la muestra de suero a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugue a más de 4000 r/min a 10 ℃ durante 10 minutos, separación del suero o filtrado del suero.

2) Tome 1 ml de suero y agregue 3 ml de la solución redisoludora diluida, mezcle durante 30 segundos.

3) Tome 50 µL de solución para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:4

5.3Miel

• Pese 1 ± 0,05 g de muestra de miel en un tubo centrífugo de 50 ml, agregue 1 ml de solución de HCl 0,5 M y colóquelo en un ambiente a 37 ℃ durante 30 minutos;
• Agregue 2,5 ml de solución de NaOH 0,2 M y 3 ml de Na₂HPO₄- C₆h₈oh₇·H₂O tampón por separado, luego agregar 4 ml de acetato de etilo, agitar durante 2 minutos, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 minutos;
• Tome 2 ml de fase orgánica de la capa superior, seque con nitrógeno a 50-60 ℃, agregue 0,5 ml de la solución diluida de redisolución para redisolver, mezcle durante 30 segundos.
• Tome 50 µL para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 1

5.4Orina

• Agregue 3 ml de la solución diluida de redisolución y 1 ml de la muestra de orina clara centrifugada, mezcle adecuadamente durante 30 segundos.
• Tome 50 µL para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 4

5.5Leche

• Tome 1 ml de leche, agregue la solución diluida que se redisuelve, diluya a 1:19 (Ⅴ/Ⅴ) (20 µL de leche + 380 µL de la solución diluida que se redisuelva), mezcle durante 30 segundos.
• Tome 50 µL para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 20

6. Procedimientos ELISA

6.1 Instrucciones

• Lleve todos los reactivos y las tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de su uso;
• Devuelva todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;
• La reproducibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de la placa.El correcto funcionamiento del lavado de placas es el punto clave en los procedimientos de ELISA;
• Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada con la membrana protectora.

6.2 Procedimientos de operación

• Saque todos los reactivos necesarios y colóquelos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos.Tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse para que se mezcle uniformemente antes de usarlo;
• Tome las tiras de micropocillos y los marcos de placas necesarios.Se volvió a sellar la microplaca no utilizada y se almacenó a 2-8 ℃;
• Preparación del tampón de lavado: diluya 40 ml del tampón de lavado concentrado 20X con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20X + 19 partes de agua desionizada).O prepare el tampón de lavado en la cantidad necesaria.
• Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar;cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado;registrar sus posiciones;
• Agregue 50 µL de la muestra o solución estándar para separar los pocillos duplicados, agregue 50 µL de conjugado enzimático y luego agregue 50 µL de la solución de trabajo del anticuerpo en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente, sellar la microplaca con la membrana de cobertura,e incubar a 25℃para30 minutos;
• Lavar la microplaca con el tampón de lavado a 250 µL/pocillo de cuatro a cinco veces. Remojar el pocillo con el tampón de lavado durante 15-30 segundos, agitar para secar con papel absorbente (si quedan burbujas después de agitar, cortarlas con las puntas limpias);
• Coloración: agregue 50 µL de la solución del sustrato A y 50 µL de la solución B en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente,e incubar a 25℃para15min en la oscuridad para colorear;
• Determinación: añadir 50 µL de solución de parada en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente.Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD.(Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar los resultados;el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de sulfametazina en la muestra.

7.1 Determinación cualitativa

El rango de concentración (ng/mL) se obtiene al comparar el valor de DO promedio de la muestra con el de la solución estándar.Suponiendo que el valor de DO de la muestraⅠ es 0,3 y el de la muestraⅡ es 1,0, el valor de DO de las soluciones estándar es: 2,243 para 0 ppb, 1,816 para 1 ppb, 1,415 para 3 ppb, 0,74 para 9 ppb, 0,313 para 27 ppb, 0,155 para 81 ppb , en consecuencia, el rango de concentración de la muestraⅠ es de 27 ppb a 81 ppb, y el de la muestraⅡ es de 3 ppb a 9 ppb.(multiplicado por el pliegue de dilución correspondiente)

7.2 Determinación cuantitativa

El valor medio de los valores de absorbancia es equivalente al porcentaje del valor OD promedio (B) de la muestra y la solución estándar dividido por el valor OD (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente se multiplica por 100%, es decir,

B: el valor de DO promedio (pocillos dobles) de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores de semilogaritmo de las soluciones estándar de sulfametazina (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente.Lea la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.Posteriormente el valor resultante se multiplica por el factor de dilución correspondiente, obteniendo finalmente la concentración de Sulfametasina en la muestra.

Usar el software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis rápido y preciso de una gran cantidad de muestras.(Por favor contáctenos para este software)

8. Precauciones

• La temperatura ambiente inferior a 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.
• La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada;Continúe con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.
• Mezcle uniformemente, de lo contrario habrá una reproducibilidad no deseada.
• La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel.
• No utilice el kit superando su fecha de caducidad.El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO.No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote a utilizar.
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla.La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
• Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.El valor de detección de la solución estándar 0 inferior a 0,5 (A450 nm< 0,5) indica su degeneración.

8. La temperatura de reacción óptima es 25 ℃, y temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad.

Almacenamiento:almacenar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad:1 año;la fecha de producción está en la caja.

Nota: Si el paquete al vacío de la microplaca tiene fugas, su uso aún es válido, no afecta el resultado de la prueba, no dude en usarlo.