LSY-10005 Kit de ensayo ELISA de neomicina para diagnóstico de seguridad alimentaria para leche, miel, huevos y piensos

NeomicinaELISApruebaEquipo

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo indirecto para la detección de neomicina en la muestra.El antígeno de acoplamiento está recubierto previamente sobre las tiras de los micropocillos.Los residuos de neomicina en la muestra y el antígeno de acoplamiento recubierto previamente en las franjas de los micropocillos compiten por el anticuerpo anti-neomicina.Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración.El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con la neomicina que contiene.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de Neomicina.

2. T.especificaciones técnicas

Ssensibilidad: 0,1 ppb

Temperatura de incubación: 25 ℃

Tiempo de incubación:30min—15 minutos

Dlímite de detección

Tejidos, leche, leche en polvo, piensos 4ppb

Pato 8ppb

Miel 7ppb

huevo 3ppb

Orina de cerdo 1ppb

Rrecuperacióntasa

Tejido 95±25%

Hígado de pollo, Hígado de cerdo 80±25%

Leche, leche en polvo, miel, huevos, piensos, orina de cerdo 90±30%

Cruz-tasa de reacción

Neomicina 100%

3.Componentes

4.Materiales necesarios pero no proporcionados.

• Equipo:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, vórtice, centrífuga, pipetas medidoras y balanza (una sensibilidad recíproca de 0,01 g), incubadora.
• micropipeta:monocanal de 20 a 200 µl, 100 a 1000 µl y multicanal de 30 a 300 µl.
• Ragentes:Ácido tricloroacético (TCA), NaOH, HCl, agua desionizada.

5.Sampliopagretratamiento

Instrucciones

Antes del pretratamiento de cualquier tipo de muestra se deben abordar los siguientes puntos:

• Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
• Antes del experimento, se debe verificar que cada equipo experimental esté limpio y se debe volver a limpiar si es necesario, para evitar la contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Spreparación de soluciónantes de la muestrapagretratamiento

• Ácido tricloroacético al 3%: disuelva 3 g de ácido tricloroacético en agua desionizada hasta obtener 100 ml.
• Solución de NaOH 1 M: disuelva 4 g de NaOH en agua desionizada hasta obtener 100 ml
• Solución de HCl 1 M: tomar 8,6 ml de HCl, añadir agua desionizada a 100 ml
• Tampón de dilución de muestra: la solución redisoludora concentrada 2x se mezcla con agua desionizada en una proporción 1:1 (1 parte de solución redisoludora concentrada + 1 parte de agua desionizada).
• Tampón de extracción de muestras: diluya el tampón de dilución de muestras con agua desionizada a 1:9 (o diluya directamente la solución redisoludora concentrada 2x con agua desionizada a 1:19).

5.1 Tejido (pollo, cerdo,pato,camarones, pescado), miel, huevomuestra

• Tome 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 8 ml de ácido tricloroacético al 3 %, agite durante 4 minutos, centrifugue a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 minutos.
• Lleve 100 µl de líquido transparente de capa superior a otro tubo, agregue 700 µl de tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 40

5.2 Hígado de cerdomuestra

• Tome 1 ± 0,05 g de la muestra de hígado de cerdo homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 5 ml del tampón de extracción de muestra, agite durante 3 minutos, colóquelo en un baño de agua a 56 ℃ durante 25 minutos, agite durante 30 segundos (o agite a mano durante 30 segundos). Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 min.
• Lleve 100 µl de líquido transparente de capa superior a otro tubo, agregue 300 µl de tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 20

5.3 Alimentarmuestra

• Tome 1 ± 0,05 g de la muestra de alimento triturada en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 9 ml de tampón de extracción de muestra y 1 ml de solución de NaOH 1 M, agite durante 3 minutos, centrifugue a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 mín.
• Lleve 100 µl de líquido transparente de capa superior a otro tubo, agregue 400 µl de tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 50

5.4 Orina de cerdomuestra

• Tome 1 ml ± 0,05 ml de muestra de orina de cerdo en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 5 ml de agua desionizada y agite durante 2 minutos para mezclarlo uniformemente.
• Tome 100 µl del líquido anterior, agregue 300 µl del tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 20

5.5 Lechemuestra

• Tome 1 ml ± 0,05 ml de la muestra de leche en un tubo de centrífuga de 10 ml, agregue 50 µl de solución de HCl 1 M, agite durante 1 minuto, centrifugue a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 minutos.
• Lleve 50 µl de líquido transparente de capa superior a otro tubo, agregue 950 µl de tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 20

5.6 Leche polvomuestra

• Tome 1 g ± 0,05 g de muestra de leche en polvo en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 7 ml de agua desionizada, agite durante 3 minutos, centrifugue a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 minutos.
• Lleve 1 ml de líquido de capa superior a otro tubo de centrífuga de 10 ml, agregue 50 µl de solución de HCl 1 M, agite durante 1 minuto, centrifugue a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 minutos.
• Lleve 100 µl de líquido transparente de capa superior a otro tubo, agregue 900 µl de tampón de dilución de muestra y agite bien para mezclarlo uniformemente.
• Tome 50 µL para análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 80

6. Procedimientos ELISA

6.1Instrucciones

• Lleve todos los reactivos y las tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de su uso;
• Devuelva todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;
• La reproducibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de la placa.El correcto funcionamiento del lavado de placas es el punto clave en los procedimientos ELISA;
• Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada con la membrana protectora.

6.2Operaciónprocedimientos

• Saque el kit del ambiente refrigerado.Saque todos los reactivos necesarios del kit y colóquelos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 min.Tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse para que se mezcle uniformemente antes de su uso.
• Tome las tiras de micropocillos y los marcos de placas necesarios.Vuelva a sellar la microplaca no utilizada, guárdela a 2-8 ℃, no congelada.
• Preparación de la solución: diluya 15 ml de tampón de lavado concentrado 20X con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20X + 19 partes de agua desionizada) para su uso, o prepárelo según la cantidad necesaria.
• Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar;cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado, registre sus posiciones.
• Agregue 50 µL de la muestra o solución estándar para separar los pocillos duplicados;Luego agregue 50 µL de conjugado enzimático y luego agregue 50 µL de la solución de trabajo del anticuerpo en cada pocillo.Mezcle suavemente agitando la placa manualmente, selle la microplaca con la membrana de cubierta yincubar en25 ℃ durante 30 minutos.
• Vierta el líquido, lave la microplaca con el tampón de lavado a 250 µL/pocillo de 4 a 5 veces.Cada vez remoje el pozo con el tampón de lavado durante 15-30 segundos, agite para secar con papel absorbente (si quedan burbujas después de aletear, córtelas con las puntas limpias).
• Coloración: añadir 50 µL del sustrato A y luego 50 µL del sustrato B en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente yincubar a los 25℃para 15mín.enoscuropara coloraciónnorte.
• Determinación: añadir 50 µL de la solución de parada en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente.Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD.(Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7.Rresultado juicio

Hay dos métodos para juzgar los resultados;el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de neomicina.

7.1determinación cualitativaación

El rango de concentración (ng/mL) se puede obtener comparando el valor de DO promedio de la muestra con el de la solución estándar.Suponiendo que el valor de DO de la muestraⅠ es 0,3 y el de la muestraⅡ es 1,0, mientras que los de las soluciones estándar son los siguientes: 2,243 para 0 ppb, 1,816 para 0,1 ppb, 1,415 para 0,3 ppb, 0,74 para 0,9 ppb, 0,313 para 2,7 ppb y 0,155 para 8,1 ppb, en consecuencia, el rango de concentración de la muestraⅠ es de 2,7 a 8,1 ppb, y el de la muestraⅡ es de 0,3 a 0,9 ppb.Multiplicar por su correspondiente factor de dilución es la concentración real de neomicina en la muestra.

7.2 qdeterminación cuantitativa

Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para el valor OD promedio (B) de la muestra y la solución estándar divididos por el valor OD (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente se multiplica por 100%, es decir,

B: el valor OD promedio de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de la solución estándar y los valores de semilogaritmo de la solución estándar de neomicina (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente.Lea la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.Posteriormente el valor resultante se multiplica por el factor de dilución correspondiente, obteniendo así finalmente la concentración de Neomicina en la muestra.

8.Precauciones

• La temperatura ambiente inferior a 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.
• La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada.
• Mezcle cada reactivo y mezcla de reacción de manera uniforme y lave bien la microplaca; de lo contrario, se producirá una reproducibilidad no deseada.
• La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel;
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla.La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
• No utilice el kit superando su fecha de caducidad.El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO.No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote a utilizar.
• Deseche la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.El valor de detección de la solución estándar 1 (0 ppb) inferior a 0,5 indica su degeneración.
• La temperatura de reacción óptima es 25 ℃. Si temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Salmacenamiento yfecha de caducidad

Salmacenamiento:almacenar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad:12 meses;La fecha de producción está en la caja.