Kit de prueba ELISA de nitrofurano (AOZ) de diagnóstico de seguridad alimentaria LSY-10002 para peces, camarones, miel, huevos y piensos

Kit de prueba ELISA de nitrofurano (AOZ)

N.º de catálogo LSY-10002

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo para la detección de AOZ en la muestra.Los antígenos de acoplamiento están recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos.El AOZ de la muestra y los antígenos de acoplamiento recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos compiten por los anticuerpos anti-AOZ.Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración.El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con el AOZ que contiene.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de AOZ.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0.02ppb

Temperatura de incubación: 25 ℃

Tiempo de incubación: 30mín.~15 millasnorte

Límite de detección

Tejido, huevo, muestras con alto contenido de grasa (piel, grasa, etc.): 0,1 ppb

Alimentación: 4ppb

Tasa de reacción cruzada

AOZ 100%

AMAZ <0,1%

HAH <0,1%

EEM <0,1%

Índice de recuperación

Tejido, huevo, alimento 95±25%

Muestras con alto contenido de grasa (piel, grasa, etc.) 90%±30%

3.Componentes

4. Materiales necesarios pero no proporcionados

• Equipos:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, vórtice, centrífuga, pipetas medidoras, balanza (sensibilidad recíproca de 0,01 g), incubadora, baño de agua;
• Micropipetas:monocanal 20-200 µL, 100-1000 µL y multicanal 30～300 µl;
• Reactivos:NaOH, acetato de etilo, n-hexano, HCl (aproximadamente 36,5%), K₂HPO₄·3H₂O, etanol absoluto

5. Pretratamiento de muestra

Instrucciones

Antes del pretratamiento de cualquier tipo de muestra se deben abordar los siguientes puntos:

• Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
• Antes del experimento, cada equipo experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

• 0,1 megaciclos₂HPO₄: disolver 11,4 g K₂HPO₄·3H₂O en agua desionizada hasta 500 ml.
• HCl 1 M: disuelva 8,6 ml de HCl (aproximadamente 36,5 %) en agua desionizada hasta obtener 100 ml.
• NaOH 1 M: disolver 4 g de NaOH en agua desionizada hasta 100 ml.
• la solución de redisolución concentrada 2x se diluye con agua desionizada a 1:1 (1 ml de solución de redisolución concentrada + 1 ml de agua desionizada), utilizada para la redisolución de la muestra.
• 50% Etanol absoluto: 1 parte de Etanol absoluto + 1 parte de agua desionizada, mezclar uniformemente.

5.1 Preparación de muestras

5.1.1Tejido, huevo

1) Pesar 1± 0,05 g de la muestra homogeneizada, añadir 4 ml de agua destilada, 0,5 ml de HCl 1 M y 100 µl de 2-nitrobenzaldehído (C₇h₅NO₃) a cada tubo, agite adecuadamente durante 2 minutos;.

2) Incubar en70℃por baño de agua para20 minutos(O incubar en una caja de temperatura constante a75℃para25 minutos).

• Añadir 5 ml 0,1 MK₂HPO₄, 0,4 ml de NaOH 1 M y 6 ml de acetato de etilo en cada tubo, agite durante 30 segundos.
• Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 minutos (si hay emulsificación o una capa de acetato de etilo no es suficiente para 3 ml, incubar la muestra en un baño de agua a 80 ℃ durante 10 minutos y centrifugar repetidamente; o aumentar la velocidad y extender tiempo de centrifugación).
• Transfiera 3 ml de la capa de acetato de etilo a un tubo centrífugo nuevo y evapore hasta sequedad con nitrógeno o aire a 50 ℃.
• Disolver los residuos secos en 2 ml de N-hexano, agregar 1 ml de la solución redisoludora diluida, mezclar adecuadamente durante 30 segundos, centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;Retire la fase de N-hexano de la capa superior (si hay emulsificación, después de eliminar la fase de N-hexano de la capa superior, incube la muestra en un baño de agua a 70 ℃ durante 10 a 20 minutos, centrifugue repetidamente).
• Tome 50 µL del inferior para su análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 2

5.1.2 Muestras ricas en grasas (piel, grasa, etc.)

1) Pesar 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada, agregar 8 ml de agua desionizada, luego agregar 5 ml de n-hexano, agitar completamente durante 3 minutos;

2) Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;

3) Tome 5 ml de la fase acuosa de la capa intermedia en un tubo centrífugo nuevo y limpio de 50 ml, agregue 0,5 ml de HCl 1 M y 100 µl de 2-nitrobenzaldehído (C7H5NO3), agite adecuadamente durante 2 minutos;

4) Incubar a 56 ℃ en baño de agua durante 2 horas;

5) Agregue 5 ml de K2HPO4 0,1 M, 0,4 ml de NaOH 1 M y 10 ml de acetato de etilo en consecuencia, agite durante 30 segundos;

6) Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;

7) Transfiera 5 ml de la capa de acetato de etilo a un tubo centrífugo nuevo y evapore hasta sequedad con nitrógeno o aire a 50 ℃;

8) Disolver los residuos secos en 2 ml de N-hexano, luego agregar 1 ml de la solución redisoludora diluida, mezclar adecuadamente durante 30 segundos, centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;Retire la fase de N-hexano de la capa superior.

9) Tome 50 µL del líquido de la capa inferior para su análisis.

Pliegue de dilución de la muestra: 2

5.1.3 Alimentación

1) Pesar 1 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada, agregar 9 ml de etanol absoluto al 50 %, luego agregar 5 ml de n-hexano, agitar completamente durante 3 minutos;

2) Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;

• Tome 5 ml de fase acuosa de capa intermedia en otro tubo de centrífuga limpio de 50 ml, agregue 0,5 ml de HCl 1 M y 100 µl de 2-nitrobenzaldehído (C₇h₅NO₃), agite completamente durante 2 minutos;
• Incubar a 70 ℃ en baño de agua durante 20 minutos;
• Añadir 5 ml 0,1 MK₂HPO₄, 0,4 ml de NaOH 1 M y 10 ml de acetato de etilo, agitar completamente durante 30 segundos;
• Centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;
• Transfiera 1 ml de la capa de acetato de etilo a un tubo centrífugo nuevo y evapore hasta sequedad con nitrógeno o aire a 50 ℃.
• Disolver los residuos secos en 2 ml de N-hexano, agregar 1 ml de la solución redisoludora diluida, mezclar adecuadamente durante 30 segundos, centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min;Eliminar la fase de N-hexano de la capa superior;
• Tome 200 µl de líquido transparente de capa inferior y 800 µl de la solución redisoludora diluida y mezcle uniformemente;
• Tome 50 l de líquido para su análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:100

6. Procedimientos ELISA

6.1Instrucciones

1) Lleve todos los reactivos y las tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de su uso;

2) Devuelva todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;

3) La reproducibilidad del análisis ELISA depende, en gran medida, de la consistencia del lavado de la placa.El correcto funcionamiento del lavado de placas es el punto clave en los procedimientos ELISA;

4) Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada con la membrana protectora.

6.2Operaciónprocedimientos

• Lleve el kit de prueba a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos, tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse para mezclarse uniformemente antes de usarlo, coloque las tiras de micropocillos requeridas en los marcos de las placas.Vuelva a sellar la microplaca no utilizada, guárdela a 2-8 ℃, no congelada.
• Preparación de la solución: diluir 40 ml de tampón de lavado concentrado 20 × con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20 × + 19 partes de agua desionizada).O prepárese según sea necesario..
• Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar;cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado, registre sus posiciones.
• Agregue 50 µL de la muestra o solución estándar en pocillos duplicados separados;agregue 50 ul de conjugado enzimático y luego 50 µl de la solución de trabajo del anticuerpo en cada pocillo, mezcle suavemente agitando la placa manualmente.Selle la microplaca con la membrana de cubierta yincubar a los 25 ℃ para30 minutos.
• Vierta el líquido del micropocillo, agite para secar sobre papel absorbente, agregue 250 l/pocillo de tampón de lavado para lavar la microplaca durante 15-30 s, luego saque y agite para secar con papel absorbente, repita 4-5 veces.(Si quedan burbujas después del aleteo, córtelas con las puntas limpias).
• Coloración: añadir 50 µL del sustrato A y luego 50 µL del sustrato B en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente, luegoincubar a 25 ℃ durante15min en la oscuridad para colorear.
• Determinación: añadir 50 µL de la solución de parada en cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente.Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD de cada pocillo.(Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar los resultados: el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de OD de la muestra tiene una correlación negativa con la concentración de AOZ.

7.1 Determinación cualitativa

El rango de concentración (ng/mL) de AOZ se puede obtener comparando el valor OD promedio de la muestra con el de la solución estándar.Suponiendo que el valor de DO de la muestraⅠ es 0,3 y el de la muestraⅡ es 1,0, el valor de DO de las soluciones estándar es: 2,243 para 0 ppb, 1,816 para 0,02 ppb, 1,415 para 0,06 ppb, 0,74 para 0,18 ppb, 0,313 para 0,54 ppb , 0,155 para 1,62 ppb, en consecuencia, el rango de concentración de la muestraⅠ es de 0,54 ppb a 1,62 ppb, y el de la muestraⅡ es de 0,06 ppb a 0,18 ppb.

7.2 Cuantitativo determinación

Los valores medios de los valores de absorbancia se obtienen para el valor OD promedio (B) de la muestra y la solución estándar dividido por el valor OD (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente se multiplica por 100%, es decir,

B: el valor OD promedio de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de la solución estándar y los valores de semilogaritmo de la solución estándar de AOZ (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente.Lea la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.Posteriormente el valor resultante se multiplica por el factor de dilución correspondiente, obteniendo finalmente la concentración de AOZ en la muestra.

8. Precauciones

• La temperatura ambiente inferior a 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.
• La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada;Continúe con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.
• Mezcle uniformemente, de lo contrario habrá una reproducibilidad no deseada.
• La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel.
• No utilice el kit superando su fecha de caducidad.El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO.No intercambie los reactivos de los kits de diferentes lotes a utilizar.
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla.La solución estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
• Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.El valor de detección de la solución estándar 1 (0 ppb) inferior a 0,5 indica su degeneración.
• La temperatura de reacción óptima es 25 ℃, y temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad.

Almacenamiento:almacenar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad:12 meses;la fecha de producción está en la caja.

Nota: Si el paquete al vacío de la microplaca tiene fugas, su uso aún es válido, no afecta el resultado de la prueba, no dude en usarlo.