Kit de ensayo ELISA para la inspección de la inocuidad de la carne de cerdo, pollo y piensos

Kit de ensayo ELISA para el dietilstilbestrol

No de catálogo LSY-10022

1Principio.

Este kit de ensayo se basa en el ensayo inmunológico enzimático competitivo para la detección de dietilstilbestrol ((DES) en los piensos, la orina, el hígado, la carne, los camarones y los peces.El antígeno conjugado se recubre previamente en las franjas de micro-pozoEl dietilstilbestrol en la muestra compite con el antígeno conjugado pre-revestido en las franjas de micro-pozo, para interactuar con los anticuerpos contra el dietilstilbestrol.Después de la adición del conjugado enzimáticoEl valor de la densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de dietilstilbestrol en la muestra.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene el contenido de dietilstilbestrol correspondiente..

2Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0.1 ppb

Temperatura de incubación: 37°C

Tiempo de incubación: 30min 30min 15min

Límites de detección

Tejido (camarones, peces)

Carne de cerdo/hígado, pollo/hígado 2 ppb

Tejido muscular ((Método dos)0.1 ppm

Orina 0,6 ppb

El valor de las emisiones de gases de efecto invernadero es el valor de las emisiones de gases de efecto invernadero.

Tasa de reacciones cruzadas

DES: el 100%

Dienestrol 38,5%

Hexestrol: 8,5%

Etilenoestradiol < 0,1%

Estriol < 0,1%

Tasa de recuperación

El contenido de orina en el producto se calculará en función de la cantidad de orina en el producto.

El valor de las emisiones de gases de efecto invernadero es el valor de las emisiones de gases de efecto invernadero.

Tejido 85 ± 10%

3. Componentes

1. Las bandas de micro-pozo: 12 bandas con 8 pozos extraíbles cada una
2. 6 × solución estándar (1 ml cada uno): 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb
3. Conjugado de enzimas (12 ml)
4. Solución de trabajo de anticuerpos (7 ml)
5. Substrato Solución A (7 ml) con tapa blanca
6. Solución de sustrato B (7 ml)
7. Solución de parada (7 ml)
8. 20 × tampón de lavado concentrado (40 ml)
9. 5 × solución de redisolución concentrada (50 ml)

4- Materiales requeridos pero no proporcionados

1. Equipo:Lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, votex, centrífuga, pipetas de medición, balanza (con sensibilidad recíproca de 0,01 g)
2. Los micropipetadores:de un solo canal de 20 a 200 μl, de 100 a 1000 μl y de varios canales de 30 a 300 μl;
3. Los reactivos:NaOH, acetonitrilo (CH)₃CN), Acetona, agua desionizada, H₃Oficina de trabajo₄(85%), acetato de etilo, CHCl₃

5Pre-tratamiento de la muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben tratarse antes del pretratamiento)

1. Sólo se podrán utilizar las puntas desechables para los experimentos y las puntas deberán cambiarse cuando se utilicen para absorber diferentes reactivos.
2. Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y, si es necesario, debe volver a limpiarse para evitar la contaminación que interfiera con los resultados del experimento.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra

1. 6 M H₃Oficina de trabajo₄: disuelven 100 ml de H₃Oficina de trabajo₄(85%) en 150 ml de agua desionizada, mezclar adecuadamente
2. 1 M NaOH: disolver 4 g de NaOH en agua desionizada hasta 100 ml
3. 2 M NaOH: disolver 8 g de NaOH en agua desionizada hasta 100 ml
4. Acetonitrilo- acetone: añadir 80 ml de acetonitrilo y 20 ml de acetone, mezclar uniformemente
5. La solución de redisolución concentrada de 5 × se mezcla con agua desionizada a 1:4 (1 ml de solución de redisolución concentrada + 4 ml de agua desionizada), utilizada para la redisolución de la muestra tratada.

5.1 Tejido (pollo, pato, carne de cerdo/hígado, camarón, pescado)

1. Se pesan 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada, se añaden 6 ml de acetonitrilo-acetona, se agitan durante 2 minutos y se centrifugan a una temperatura superior a 4000 r/min a 15 °C durante 10 minutos.
2. Trasladar 3 ml de supernatante a un nuevo tubo de centrifugadora, soplar para secar con nitrógeno o aire a 60 °C.
3. Añadir 0,5 ml de CHCl₃, vórtice durante 20 segundos, añadir 2 ml 2 M NaOH, vórtice durante 30 segundos, centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min durante 5 minutos.
4. Se toma 1 ml de supernatante, se añaden 200 μL de 6 M H₃Oficina de trabajo₄, el vórtice durante 5 segundos.
5. Añadir 3 ml de acetonitrilo (CH)₃CN) para extracción, agitar adecuadamente durante 2 minutos, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 10 minutos, extraer la capa superior, soplar para secar con nitrógeno o aire a 60 °C.
6. Disolver los residuos secos en 1 ml de la solución de redisolución diluida.

Diluir según el método siguiente para diferentes muestras

1. Camarones y pescado----- tomar directamente la fase de agua de 50 μL para su detección;
2. Carne de cerdo/hígado, pollo/hígado----- tomar 50 μL de fase acuosa, añadir 450 μL de la solución de redisolución diluida, agitar adecuadamente durante 30 s. Tomar 50 μL para análisis.

Doble de dilución de la muestra:

Camarones y pescado----2 Carne de cerdo/hígado, Pollo/hígado------20

5.2 Método de tejido muscular segundo

1) Se toman 2 ± 0,05 g de muestra homogeneizada, se añaden 2 ml de 2 M NaOH, se agitan durante 2 min.

2) Añadir 8 ml de acetato de etilo, agitar violentamente durante 5 minutos;

3) Centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min a 15 °C durante 10 min.

4) Tomar 4 ml de fase orgánica superior, soplar para secar con nitrógeno o aire a 60 °C

5) Se disuelven los residuos secos en 1 ml de la solución redisolvente diluida, se agita durante 30 minutos.

Plegado de dilución de la muestra: 1

5.3 Alimentación

1) Se pesan 2 ± 0,05 g de la muestra homogeneizada, se añaden 8 ml de acetonitrilo, se agitan correctamente durante 2 min, se centrifugan a una temperatura superior a 4000 r/min a 15 °C durante 10 min.

2) Se introducen 2 ml de supernatante en un nuevo tubo de centrifugadora, se sopla para secar con nitrógeno o aire a 60 °C.

3) Añadir 0,5 ml de CHCl₃, vórtice durante 20 segundos, añadir 2 ml 1 M NaOH, vórtice durante 30 segundos, centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min durante 5 minutos.

4) Se toma 1 ml de supernatante, se añaden 100 μL de 6 M H₃Oficina de trabajo₄, vórtice durante 5 segundos

Diluir según el método siguiente para diferentes muestras

Compuesto de piensos-- tomar una muestra de 50 μL, añadir 950 μL de la solución de redisolución diluida, girar durante 30 segundos, tomar 50 μL para el análisis;

Alimentos para animales concentrados/premezclados-- toma una muestra de 25 μL, agrega 975 μL de la solución de redisolución diluida, vórtice durante 30 segundos, toma 50 μL para el análisis.

Doble de dilución de la muestra:

Alimentos compuestos para animales ---------100 Alimentos concentrados o premezclados ----------200

5.4 Orina

1. Se introducen 2 ml de orina en el tubo de centrifugadora, se centrifugan a una velocidad superior a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25) durante 10 minutos, se detiene cuando está despejado.
2. Transfiere 1 ml de orina clara al tubo de centrifugadora, añade 1 ml de 1 M NaOH, agita vigorosamente durante 5 min.
3. Se añaden 100 μL 6 M H₃Oficina de trabajo₄, vórtice durante 30 segundos
4. Añadir 8 ml de CHCl₃para la extracción, agitar adecuadamente durante 5 minutos, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a 15°C durante 10 minutos.
5. Se retira la capa superior (fase de agua), se toman 4 ml de la capa inferior, se sopla para secar con nitrógeno o aire a 60 °C.
6. Disolver los residuos secos en 3 ml de la solución de redisolución diluida, agitar durante 30 minutos.
7. Tomar 50 μL para su análisis.

Doble de dilución de la muestra: 6

6Procedimientos de ELISA

6.1 Instrucciones

1. Antes de su uso, llevar todos los reactivos y las tiras de micro-pozo a temperatura ambiente (20-25 °C).
2. Devolver todos los reactivos a 2-8 °C inmediatamente después de su uso
3. La reproducibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de platos, siendo el correcto funcionamiento del lavado de platos el punto clave de los procedimientos de ELISA.
4. Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada por la membrana de cubierta.

6.2 Procedimientos de funcionamiento

1. Sacar el kit del ambiente refrigerado, sacar todos los reactivos necesarios del kit y colocarlos a temperatura ambiente (20-25°C) durante al menos 30 minutos.Tenga en cuenta que cada reactivo líquido debe agitarse para mezclarse uniformemente antes de su uso.
2. Retirar las tiras y los marcos de las placas de micro-pozo requeridos.
3. Preparación de la solución: diluir el tampón de lavado concentrado 20× con agua desionizada hasta 800 ml (o sólo hasta el volumen requerido) para su uso.
4. Numeración: se numeran los micro-pozos de acuerdo con las muestras y la solución estándar; cada muestra y solución estándar deben realizarse en duplicado; se registran sus posiciones.
5. Añadir 50 μL de la muestra o de la solución estándar a los pozos duplicados separados; añadir 50 μL de la solución de trabajo de anticuerpos a cada pozos.Incubación a los 37 años°Cdurante 30 minutos.
6. Se verterá el líquido de los micro-pozos, se añadirá 250 μL/pozo de amortiguador de lavado durante 10 segundos, se repetirá de cuatro a cinco veces, y luego se secará con papel absorbente (si hay burbujas después de la operación,cortarlos con las puntas limpias).
7. Añadir 100 μL de enzima conjugada en cada pozo, sellar la microplaca con la membrana de cubierta,Reaccionar en 37°Cdurante 30 minutos,continuar como se describe en el punto 6
8. Coloración: añadir 50 μL de solución de sustrato A y luego 50 μL de solución de B en cada pozo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente, sellar la microplaca con la membrana de cubierta yIncubación a los 37 años°Cdurante 15 minutos en la oscuridad para la coloración.
9. Determinación: añadir 50 μL de la solución de parada en cada pozo. Mezclar suavemente sacudiendo la placa manualmente.Establecer la longitud de onda del lector de microplacas en 450 nm para determinar el valor de OD (se recomienda leer el valor de OD en la doble longitud de onda 450/630 nm en un plazo de 5 min)

7. Juicio del resultado

Hay dos métodos para juzgar los resultados; el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de la DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de dietilstilbestrol (DES).

7.1 Determinación cualitativa

El intervalo de concentración (ng/mL) se puede obtener mediante la comparación del valor medio de la DO

El valor OD de la muestra I es 0.3, y el de la muestra II es 1.0, mientras que las de las soluciones estándar son las siguientes: 2,243 para 0 ppb, 1,816 para 0,1 ppb, 1,415 para 0,3 ppb, 0,74 para 0,9 ppb, 0,313 para 2,7 ppb y 0,155 para 8,1 ppb,En consecuencia, el rango de concentración de la muestra es 2de 0,7 a 8,1 ppm, y la muestra II es de 0,3 a 0,9 ppm (multiplicada por el doble de dilución correspondiente)

7.2 Cuantitativo determinación

Los valores medios de los valores de absorbancia son equivalentes al porcentaje del valor medio de OD (B) de la muestra y de la solución estándar dividido por el valor de OD (B)₀) de la primera solución estándar (0 estándar) y posteriormente multiplicado por 100%, es decir,

B­el valor medio de OD (dobles pozos) de la muestra o de la solución estándar

B. El trabajo₀∆el valor medio de la DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibujar la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores del semilogaritmo de las soluciones estándar de dietilstilbestrol (DES) (ng/mL) como eje Y y eje X, respectivamente..Se leerá la concentración correspondiente de la muestra a partir de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.El valor resultante se multiplica posteriormente por el doble de dilución correspondiente., obteniendo así finalmente la concentración de dietilstilbestrol (DES) en la muestra.

El uso del software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis preciso y rápido de una gran cantidad de muestras.

8Las precauciones

1. La temperatura ambiente inferior a 25 °C o la temperatura de los reactivos y de las muestras que no vuelvan a la temperatura ambiente (20-25 °C) darán lugar a un valor estándar de OD inferior.
2. La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado se verá acompañada de situaciones como las curvas estándar no lineales y la reproductibilidad indeseable.Así que continúa con el siguiente paso inmediatamente después de lavar
3. Mezclar uniformemente, de lo contrario habrá la reproductibilidad indeseable
4. La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico de 2 M, evitar el contacto con la piel.
5. El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits dará lugar a cambios en la sensibilidad y en los valores de detección de la dosis.No se intercambien los reactivos de los kits de diferentes números de lote para su uso.
6. Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa que se sella automáticamente para volver a sellarla.
7. Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.5) indica su degeneración
8. La temperatura de reacción óptima es de 37 °C, y temperaturas demasiado altas o bajas darán lugar a cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad

El almacenamiento:almacenar a 2-8 °C, no congelado.

Fecha de caducidad:12 meses; la fecha de producción está en la caja.

La empresa de biotecnología Shenzhen Lvshiyuan Co., Ltd.

D Edificio, Parque industrial biológico nacional de la vida marina, No.2 Binhai Road, Dapeng, Shenzhen, China, 518120

Tel. 86-755-28438788 El teléfono está en el teléfono.

Por fax 86-755-28938800

El correo electrónico:Información sobre las medidas de seguridad

La Comisión ha adoptado una decisión sobre la aplicación de la presente Decisión.