Kit de ensayo ELISA de enrofloxacina para huevo

Kit ELISA de Enrofloxacina

Catálogo No.LSY-10017J2b

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el ensayo de inmunoabsorción enzimática competitivo para la detección de Enrofloxacina en muestras. Los antígenos de acoplamiento están pre-recubiertos en las tiras de micropocillos. La Enrofloxacina en la muestra y los antígenos de acoplamiento pre-recubiertos en las tiras de micropocillos compiten por los anticuerpos anti-Enrofloxacina. Después de la adición del conjugado enzimático, se añade el sustrato TMB para la coloración. El valor de densidad óptica (DO) de la muestra tiene una correlación negativa con la Enrofloxacina en la muestra. Este valor se compara con la curva estándar y, posteriormente, se obtiene la concentración de Enrofloxacina.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0.1 ppb

Temperatura de incubación: 25℃

Tiempo de incubación: 30min—15min

Límite de detección

Tejido, huevo..................................................................................... 10 ppb

Tasa de reacción cruzada:

Enrofloxacina..................................................................................... 100%

Tasa de recuperación:

Tejido, huevo................................................................................... 90±30%

3. Componentes

1. Tiras de micropocillos: 12 tiras con 8 pocillos extraíbles cada una
2. 6× solución estándar (1 ml cada una): 0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb y 8.1ppb
3. Estándar de alta concentración (1 ml): 1 ppm
4. Conjugado enzimático (7 ml) ………………………………………………….tapa roja
5. Solución de trabajo de anticuerpos (7 ml)................................................... tapa azul
6. Solución de sustrato A (7 ml)......................................................... tapa blanca
7. Solución de sustrato B (7 ml)......................................................... tapa negra
8. Solución de parada (7 ml).................................................................. tapa amarilla
9. Tampón de lavado concentrado 20× (15 ml)..................................... tapa blanca

10. Tampón de extracción A 20× (15 ml)................................................... tapa amarilla
11. Tampón de extracción B 2× (50 ml*2).......................................... tapa transparente
12. Diluyente de muestra 10× (10 ml).......................................................... tapa negra

4. Materiales requeridos pero no proporcionados

1. Equipos:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, vortex, centrífuga, pipetas de medición, balanza (sensibilidad recíproca de 0.01 g)
2. Micro pipetas: monocanal 20-200 µL, 100-1000 µL y multicanal 250 µL;
3. Reactivos: NaOH

5. Pretratamiento de la muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben tratarse antes del pretratamiento)

1. Solo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
2. Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar la contaminación que interfiere con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

1. Tampón de extracción A: 1 parte de tampón de extracción A 20× + 19 partes de agua desionizada.
2. Tampón de extracción B: 1 parte de tampón de extracción B 2× + 1 parte de agua desionizada.
3. Solución de NaOH 1M: tomar 4 g de sólido NaOH, agregar agua desionizada hasta 100 ml.
4. Diluyente de muestra: 1 parte de diluyente de muestra 10× + 9 partes de agua desionizada.

5.1 Tejido, huevo

1) Pesar 2 ± 0.05 g de la muestra de tejido homogeneizado o muestra de huevo en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 3 ml del tampón de extracción A, vortex durante 3 min;

2) Luego agregar 600μl de solución de NaOH 1M y 2.4 ml de tampón de extracción B, vortex durante 3 min; centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente durante 5 min;

3) Tomar 40μl de líquido claro de la capa superior, agregar 960μl de diluyente de muestra, mezclarlo uniformemente;

4) Tomar 50µl de la solución mezclada anterior para un análisis posterior.

Factor de dilución de la muestra: 100

6. Procedimientos ELISA

6.1 Instrucciones

1. Llevar todos los reactivos y tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de usar;
2. Volver a colocar todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;
3. La reproducibilidad del análisis ELISA, en gran medida, depende de la consistencia del lavado de la placa. La operación correcta del lavado de la placa es el punto clave en los procedimientos de ELISA;
4. Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz, y cada microplaca debe sellarse con la membrana de cubierta.

6.2 Procedimientos de operación

1. Sacar todos los reactivos necesarios y colocarlos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos. Tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse para mezclarlo uniformemente antes de usarlo;
2. Tomar las tiras de micropocillos y los marcos de placa necesarios. Volver a sellar la microplaca sin usar, almacenada a 2-8 ℃;
3. Preparación de la solución: diluir 15 ml del tampón de lavado concentrado 20× con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20× + 19 partes de agua desionizada), o preparar según la cantidad necesaria;
4. Numeración: numerar los micropocillos de acuerdo con las muestras y la solución estándar; cada muestra y solución estándar deben realizarse por duplicado; registrar sus posiciones;
5. Agregar 50 µL de la muestra o solución estándar a pocillos duplicados separados, agregar 50 µL de conjugado enzimático, luego agregar 50 µL de la solución de trabajo de anticuerpos en cada pocillo. Mezclar agitando suavemente, sellar la microplaca con la membrana de cubierta yincubar a 25℃ durante 30 minutos;
6. Lavar la microplaca con el tampón de lavado a 250 µL/pocillo durante cuatro a cinco veces, remojar el pocillo con el tampón de lavado durante 15-30 segundos, aletear para secar con papel absorbente (si hay burbujas después de aletear, córtelas con las puntas limpias);
7. Coloración: agregar 50 µL de la solución de sustrato A, luego agregar 50 µL de la solución B en cada pocillo. Mezclar agitando suavemente, y incubar a 25 ℃ durante 15 minutos en la oscuridad para la coloración;
8. Determinación: agregar 50 µL de solución de parada en cada pocillo. Mezclar agitando suavemente. Ajustar la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de DO. (se recomienda leer el valor de DO a la doble longitud de onda 450/630 nm en 5 minutos).

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar los resultados; el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa. Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de Enrofloxacina en la muestra.

7.1 Determinación cualitativa

El rango de concentración (ng/mL) obtenido de la comparación del valor de DO promedio de la muestra con el de la solución estándar. Suponiendo que el valor de DO de la muestraⅠ es 0.3, y el de la muestraⅡ es 1.0, el valor de DO de las soluciones estándar es: 2.243 para 0 ppb, 1.816 para 0.1 ppb, 1.415 para 0.3 ppb, 0.74 para 0.9 ppb, 0.313 para 2.7 ppb, 0.155 para 8.1 ppb, en consecuencia, el rango de concentración de la muestraⅠ es de 2.7 a 8.1 ppb, y el de la muestraⅡ es de 0.3 a 0.9 ppb. (multiplicado por el factor de dilución correspondiente)

7.2 Determinación cuantitativa

Los valores medios de los valores de absorbancia son equivalentes al porcentaje del valor de DO promedio (B) de la muestra y la solución estándar dividido por el valor de DO (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente multiplicado por 100%, es decir,

B—el valor de DO promedio (pocillos dobles) de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor de DO promedio de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibujar la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores semilogarítmicos de las soluciones estándar de Enrofloxacina (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente. Leer la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar. El valor resultante se multiplica posteriormente por el factor de dilución correspondiente, obteniendo finalmente la concentración de Enrofloxacina en la muestra.

El uso del software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis preciso y rápido de una gran cantidad de muestras. (Por favor, contáctenos para este software)

8. Precauciones

1. La temperatura ambiente por debajo de 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) conducirán a un valor de DO estándar más bajo.
2. La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado se acompañará de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad indeseable; Por lo tanto, continuar con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.
3. Mezclar uniformemente, de lo contrario habrá una reproducibilidad indeseable.
4. La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evitar el contacto con la piel.
5. No utilice el kit superando su fecha de caducidad. El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits conducirá a cambios en la sensibilidad y los valores de DO de detección. No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote para su uso.
6. Colocar la microplaca sin usar en una bolsa de autosellado para volver a sellarla. La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
7. Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución. El valor de detección de la solución estándar 0 de menos de 0.5 (A450 nm< 0.5) indica su degeneración.

8. La temperatura óptima de reacción es de 25 ℃, y las temperaturas demasiado altas o demasiado bajas darán como resultado cambios en la sensibilidad de detección y los valores de DO.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad

Almacenamiento: almacenar a 2-8 ℃, no congelar.

Fecha de caducidad: 1 año; la fecha de producción está en la caja.

Nota: Si el paquete al vacío de la microplaca tiene fugas, aún es válido para su uso, no afecta el resultado de la prueba, relájese para usarlo.

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