Imunodiagnóstico de enzimas competitivas indirectas para la detección de estreptomicina en carne, miel, leche y huevos

Kit de pruebas ELISA de estreptomicina

No de catálogo LSY-10024-2

1Principio.

Este kit de ensayo se basa en el ensayo inmunológico de enzimas competitivas indirectas para la detección de estreptomicina en la muestra.La estreptomicina en la muestra y los antígenos de acoplamiento pre-revestidos en las franjas de micro-pozo compiten por los anticuerpos contra la estreptomicina.Después de añadir el conjugado enzimático, se añade el sustrato TMB para la coloración.El valor de la densidad óptica (DO) de la muestra de ensayo tiene una correlación negativa con la concentración de estreptomicina en la muestra.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de estreptomicina.

2Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0, 1 ppb

Temperatura de incubación: 25°C

Tiempo de incubación: 30min 30min 15min

Límites de detección:

Tejidos y tejidos de las células y tejidos de las células

En el caso de los productos que no estén sujetos a restricciones de los derechos de aduana, la autoridad competente podrá, en su caso, determinar si los productos están sujetos a restricciones de los derechos de aduana.

Leche, leche en polvo 5 ppb

Huevo 10 ppb

Tasa de recuperación:

Tejido, miel, leche, huevo 85±15%

Tasa de reacciones cruzadas:

El tratamiento con este fármaco debe realizarse en un laboratorio de la Unión.

Dihidrostreptomicina 100%

Calamicina 6,3%

La gentamicina es un medicamento que contiene una cantidad de 2,5% de gentamicina.

3. Componentes

1. Las bandas de micro-pozo: 12 bandas con 8 pozos extraíbles cada una
2. 6 veces la solución estándar (1 ml cada una): 0ppb, 0,1ppb, 0,3ppb, 0,9ppb, 2,7ppb, 8,1ppb
3. Estándar de alta concentración (1 ml): 1 ppm
4. Conjugado de enzimas (11 ml)
5. Solución de trabajo de anticuerpos (5.5 ml)
6. Substrato Solución A (6 ml) con tapa blanca
7. Solución de sustrato B (6 ml)
8. Solución de parada (6 ml) tapa amarilla
9. 20 × tampón de lavado concentrado (40 ml)

10) 5× solución de redisolución concentrada (50 ml)

4- Materiales requeridos pero no proporcionados

1. Equipamiento:Lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, vórtice, centrifugadora, pipetas de medición, balanza (con una sensibilidad recíproca de 0,01 g).
2. Los micropipetadores:de un solo canal de 20 a 200 μL, de 100 a 1000 μL y de varios canales de 300 μL;
3. Los reactivos:NaOH, Na₂HPO4·12H₂O, NaH₂P4·2H₂O, N-hexano, diclorometano ((CH)₂C.L.₂), acetonitrilo (CH)₃El ácido fosfórico₃Oficina de trabajo₄), ácido acético glacial, metanol

5Pre-tratamiento de la muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben tratarse antes del pretratamiento)

1) Solo se pueden utilizar las puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se utilizan para diferentes reactivos;

2. Antes del experimento, cada equipo experimental debe estar limpio y, si es necesario, debe volver a limpiarse, a fin de evitar la contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

1) 0,05 M PB tampón: peso de 12,9 g Na₂HPO₄·12H₂O y 2.175 g de NaH₂P4·2H₂O, añadir 1000 ml de agua desionizada para disolver.

2) 0,04 M Ácido fosfórico ((H₃Oficina de trabajo₄) (para la preparación de miel): tomar 1 ml de ácido fosfórico concentrado ((H₃Oficina de trabajo₄), añadir agua desionizada a 360 ml.

3) 1M de solución de NaOH (para la preparación de miel): pesar 4 g de NaOH, añadir agua desionizada a 100 ml.

4) 1% de ácido acético glacial (para la preparación de huevos): tomar 1 ml de ácido acético glacial, añadir 99 ml de agua desionizada, mezclar uniformemente.

5) 70% de metanol (para la preparación de huevos): tomar 700 ml de metanol, añadir 300 ml de agua desionizada, mezclar uniformemente.

6) Solución de redisolución: la solución de redisolución concentrada 5 × se diluye con agua desionizada a 1:4 (1 ml de solución de redisolución concentrada + 4 ml de agua desionizada),La solución redisolvente diluida puede conservarse a 4°C durante un mes..

5.1 Tejido (pollo, cerdo, vacuno, cordero, etc.)

1 Se toman 2 ± 0,05 g de muestra homogeneizada ((se elimina la grasa), se añaden 8 ml de 0,05 ml de PB Buffer, se agita durante 5 minutos, se pone en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos;

2 Centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min a temperatura ambiente durante 10 min.

3 Tomar 1 ml de líquido transparente de capa superior en un recipiente nuevo, añadir 1 ml de N-hexano, mezclarlo de manera uniforme, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a temperatura ambiente durante 5 min.

4 Se extrae la fase orgánica de la capa superior, se toma 50 ml de líquido de la capa inferior, se añade 450 μl de la solución redisolvente diluida y se mezcla correctamente durante 30 segundos.

5 Tomar 50 μL para el análisis.

Doble de dilución de la muestra: 40 Límites de detección: 4 pppb

5.2 Miel, jalea real

1 Pesar 2±0,05 g de muestra de miel, añadir 4 ml de ácido fosfórico (0,04 M H3PO4)_,agitar hasta que se disuelva por completo, centrifugar a una temperatura superior a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 5 minutos, hasta que esté clara ((la muestra de miel no necesita centrifugada, puede dirigirse al paso 2).

2 Añadir 450ul 1M NaOH y ajustar el valor de PH entre 7 y 9 (la jalea real necesita transferir todo el líquido transparente de la capa superior a un nuevo tubo de centrifugadora limpio y ajustar el valor de PH entre 7 y 9),Centrifugado a una velocidad superior a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 5 minutos, hasta que esté despejado.

3 Tomar 50 μL de líquido transparente de capa superior, añadir 450 μL de la solución de redisolución diluida, mezclar uniformemente durante 30 segundos.

4 Tomar 50 μL para su posterior análisis.

Doble de dilución de la muestra: 20 Límites de detección: 2 ppm

5.3 Leche en polvo

1 Se toma una muestra de 2 ± 0,05 g, se añade 8 ml de tampón PB 0,05 M, se agita durante 5 minutos, se pone en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos;

2 Centrifugar a una velocidad superior a 4000 r/min a temperatura ambiente durante 10 min.

3 Se retira la grasa de la capa superior, se toma un líquido transparente de 50 ml de la capa media, se añade 450 μl de la solución redisolvente diluida y se mezcla correctamente durante 30 segundos.

5 Tomar 50 μL para el análisis.

Doble de dilución de la muestra:50 Límites de detección: 5 ppm

5.4 Huevo

1 Los huevos fueron pelados y homogeneizados, se toma 1 g ± 0,05 g en un tubo centrífugo de 50 ml, primero se añade 2 ml de 1% de ácido acético glacial, se agita durante 2 min, luego se añade 7 ml de 70% de metanol, se agita durante 2 min.Centrifugado a 4000 r/min a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 10 minutos.

2 Se toma 0,1 ml de líquido de capa superior en un tubo centrífugo de 1,5 ml, se añade 0,9 ml de la solución redisolvente diluida, se mezcla de manera uniforme durante 30 segundos.

3 Tomar 50 μL para su posterior análisis.

Doble de dilución de la muestra: 100 Límites de detección: 10 ppm

6Procedimientos de ELISA

Instrucciones

1. Se llevarán todos los reactivos y las tiras de micro-pozo a temperatura ambiente (20-25°C).
2. Devolver todos los reactivos a 2-8°C inmediatamente después de su uso.
3. La reproductibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la coherencia de los resultados obtenidos.

El correcto funcionamiento del lavado de platos es el punto clave en los procedimientos de ELISA.

4. Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada por la membrana de cubierta.

Procedimiento de funcionamiento

1. Coloque el kit de ensayo a temperatura ambiente (20-25 °C) durante al menos 30 minutos, tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse uniformemente antes de su uso; coloque las tiras de micro-pozo necesarias en los marcos de las placas.Se vuelve a sellar la microplaca no utilizada, conservados a 2-8 °C, no congelados.
2. Preparación de la solucióndiluir 40 ml del tampón de lavado concentrado de 20 × con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado de 20 × + 19 partes de agua desionizada), o preparar la cantidad necesaria;
3. Numeración: se numeran los micro-pozos según las muestras y la solución estándar; cada muestra y solución estándar deben realizarse en duplicado; se registran sus posiciones.
4. Añadir 50 μL de la muestra y de la solución estándar a los pozos duplicados separados, luego añadir 50 μL de solución de trabajo de anticuerpos a cada pozos, agitar adecuadamente, sellar la microplaca con la membrana de cubierta yIncubación a 25 °C durante 30 minutos;
5. Se verterá líquido fuera del microcubo, se añadirá 350 μl/cubo de tampón de lavado diluido, se sacará y se repetirá 5 veces, cada vez durante 30 segundos.Por último, seque con papel absorbente si hay burbujas después de golpear., cortar con las puntas limpias);.
6. Añadir 100 μL de enzima conjugada a cada pozo, agitar adecuadamente, sellar la microplaca con la membrana de cubierta yIncubación a 25 °C durante 30 minutosContinuar con el paso 5 para el lavado.
7. Coloración: añadir 50 μL de la solución de sustrato A, luego 50 μL de la solución B en cada pozo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente yIncubación a 25 °C durante 15 minutosen la oscuridad para la coloración;
8. Determinación: añadir 50 μL de la solución de parada en cada pozo. Mezclar suavemente sacudiendo la placa manualmente. Ajustar la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD de cada pozo.(Se recomienda leer el valor OD a la doble longitud de onda 450/630 nm en un plazo de 10 minutos).

7. Juicio del resultado

Hay dos métodos para juzgar los resultados; el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor OD de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de estreptomicina.

7.1 Determinación cualitativa

El intervalo de concentración (ng/mL) se puede obtener comparando el valor medio de la OD de la muestra de ensayo con el de la solución estándar, suponiendo que el valor de la OD de la muestra I sea 0.3, y el de la muestra II es 1.0, el valor OD de las soluciones estándar es: 2.243 para 0ppb, 1.816 para 0.1ppb, 1.415 para 0.3ppb, 0.74 para 0.9ppb, 0.313 para 2.7ppb, 0.155 para 8.1ppb,Por consiguiente, el rango de concentración de la muestraI es 0..1 a 0,9 ppm y la muestra II es de 2,7 a 8,1 ppm.

1. Cuantitativo determinación

Los valores medios de los valores de absorbancia son equivalentes al porcentaje del valor medio de OD (B) de la muestra de ensayo y de la solución estándar dividido por el valor de OD (B)₀) de la primera solución estándar (0 estándar) y posteriormente multiplicado por 100%, es decir,

B­el valor medio de OD (dobles pozos) de la muestra de ensayo o de la solución estándar

B. El trabajo₀∆el valor medio de la DO de la solución estándar de 0 μg/L

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores semilogarítmicos de las soluciones estándar de estreptomicina (μg/L) como eje Y y eje X, respectivamente.Se leerá la concentración correspondiente de la muestra de ensayo a partir de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándarEl valor resultante se multiplica posteriormente por el doble de dilución correspondiente, obteniendo finalmente la concentración de estreptomicina en la muestra.

El uso del software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis preciso y rápido de una gran cantidad de muestras.

8Las precauciones

1. La temperatura ambiente inferior a 25 °C o la temperatura de los reactivos y las muestras de ensayo no devueltas a la temperatura ambiente (20-25 °C) darán lugar a un valor de OD estándar inferior.
2. La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado se verá acompañada de situaciones como las curvas estándar no lineales y la reproductibilidad indeseable.Así que continúa con el siguiente paso inmediatamente después de lavar.
3. Mezclar uniformemente, de lo contrario habrá la reproductibilidad indeseable.
4. La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evitar el contacto con la piel.
5. El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits dará lugar a cambios en la sensibilidad y en los valores de detección de la DO.No se intercambien los reactivos de los kits de diferentes números de lotes para su uso.
6. Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa de sellado automático para volver a sellarla.
7. Se desechará la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.
8. La temperatura de reacción óptima es de 25 °C, y temperaturas demasiado altas o bajas darán lugar a cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad

El almacenamiento:almacenados a una temperatura de 2-8 °C, no congelados.

Fecha de caducidad:12 meses; la fecha de producción está en la caja

La empresa de biotecnología Shenzhen Lvshiyuan Co., Ltd.

D Edificio, Parque industrial biológico nacional de la vida marina, calle Binhai No. 2, Dapeng, Shenzhen, China, 518120

Telefono: 86-755-28438788 Fax: 86-755-28938800 El número de teléfono es el siguiente:

El correo electrónico:Información sobre las medidas de seguridad

La Comisión ha adoptado una decisión sobre la aplicación de la presente Decisión.