Equipo de prueba de residuos de antibióticos del equipo de prueba ELISA de fluoroquinolona LSY-10016

Fluoroquinolona(FQNS) Kit ELISA

N.º de catálogo LSY-10016

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo para la detección de fluoroquinolona en muestras.Los antígenos de acoplamiento están recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos.La fluoroquinolona de la muestra y los antígenos de acoplamiento recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos compiten por los anticuerpos anti-fluoroquinolona.Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración.El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con la fluoroquinolona en la muestra.Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtiene la concentración de Fluoroquinolona.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad:1ppb

Temperatura de incubación: 25 ℃

Tiempo de incubación: 30 minutos—15 minutos

Límite de detección

Enrofloxacina (ENR) 1ppb

Ciprofloxacina (CIF) aproximadamente 1 ppb

Ofloxacina (OFL) aproximadamente 1 ppb

Danofloxacina (DAN) aproximadamente 1 ppb

Norfloxacina (NOR) aproximadamente 0,5 ppb

Lomefloxacina (LOM) aproximadamente 1 ppb

Pefloxacina (PEF) aproximadamente 0,5 ppb

Enoxacina (ENO) aproximadamente 1 ppb

Ácido Aosuo Li (OXO) aproximadamente 1 ppb

Ácido fluoroquinolona (GRIPE) aproximadamente 1 ppb

Ma Paul Sand Star (MAR) aproximadamente 1 ppb

Difloxacina amoniacal (AMI) aproximadamente 1 ppb

Esa difloxacina (NAD) alrededor de 2 ppb

Tasa de reacción cruzada:

Enrofloxacina (ENR) 100%

Ciprofloxacino (CIF) 92,88%

Ofloxacina (OFL) 98,86%

Ácido Aosuo Li (OXO) 116,86%

Danofloxacina (DAN) 102,63%

Norfloxacino (NOR) 148,65%

Lomefloxacina (LOM) 86,24%

Pefloxacina (PEF) 156,60%

Enoxacina (ENO) 98,97%

Ácido fluoroquinolona (GRIPE) 96,73%

Estrella de arena Ma Paul (MAR) 110,63%

Difloxacina amoniacal (IAM) 98,86%

Que difloxacina (NAD) 56,81%

Índice de recuperación

Tejido, óvulo, suero 80±15%

Miel 75±15%

3. Componentes

4. Materiales necesarios pero no proporcionados

• Equipos:lector de microplacas, impresora, homogeneizador, dispositivo de secado de nitrógeno, vórtice, centrífuga, pipetas medidoras, balanza (una sensibilidad recíproca de 0,01 g)
• Micropipetas:monocanal 20-200 µL, 100-1000 µL y multicanal 250 µL;
• Reactivos:HCl, cloruro de metileno, acetonitrilo (CH₃CN), N-hexano, Na₂HPO₄·12H₂Oh, NaH₂correos₄·2H₂O, heparina sódica

5. Pretratamiento de muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben abordarse antes del pretratamiento)

1) Este kit de prueba puede detectar muestras de tejido: tejido animal, aves de corral, acuático.Ej: Pollo, pato, bovino, conejo, pescado, camarón, etc.

• Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;
• Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar la contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

• HCl 0,1 M: 860 µl de HCl (36%) + 100 ml de agua desionizada.
• Acetonitrilo (CH₃CN) -Solución mezcladora de cloruro de metileno

V_acetonitrilo-V_{cloruro de metileno}=1: 4

• Tampón PB pH 7,2 0,02 M: disolver 5,16 g de Na₂HPO₄·12H₂O + 0,87 g NaH₂correos₄·2H₂O en el agua desionizada hasta 1 L.
• Acetonitrilo (CH₃CN)- Cloruro de metileno- Solución de mezcla de HCl 0,1 M

100 ml de acetonitrilo (CH₃CN) -Solución mezcladora de cloruro de metileno (V_acetonitrilo-V_{cloruro de metileno}= 4: 1), agregue 5 ml de solución de HCl 0,1 M.

• La solución de redisolución concentrada 2X se diluye con agua desionizada a 1:1 (1 ml de solución de redisolución concentrada + 1 ml de agua desionizada), utilizada para la redisolución de la muestra.

5.1Tejidos (pollo/hígado, cerdo/hígado, pescado, camarones, etc.), huevo

1) Pesar 2,0 ± 0,05 g de la muestra de tejido homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml.

2) Añadir 8 ml de Acetonitrilo (CH₃CN) -Solución de mezcla de cloruro de metileno, agitar durante 5 min, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 min

3) Tome 4 ml de la fase orgánica transparente (capa superior) en un tubo seco, sople para secar completamente con nitrógeno o aire mediante evaporación rotatoria a 56 ℃.

• Disolver los residuos secos en 1 ml de la solución redisoludora diluida, agregar 1 ml de N-hexano, mezclar durante 30 segundos;Centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 5 min.
• Retire la capa superior y tome 50 µl de solución de la capa inferior para realizar más análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:1

5.2 suero

1) Utilice un tubo de centrífuga con heparina sódica (20-30 unidades/ml de sangre) para recolectar la muestra de sangre de pollo (Sugerencia: se recomienda enjuagar las jeringas de recolección de sangre con heparina). Coloque la muestra de sangre a temperatura ambiente durante 1 hora.Después de obtener el plasma, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 minutos y extraer 1 ml de plasma.

2) Agregar CH₃CN (sin agua) 4 ml, mezclar bien de arriba a abajo durante 5 min, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 min.

3) Mueva el sobrenadante transparente (capa superior) a otro tubo de centrífuga, agregue 2 ml de tampón PB 0,02 M y mezcle uniformemente.

4) Añadir 5 ml de cloruro de metileno, mezclar uniformemente durante 5 minutos, centrifugar a más de 4000 r/min a

15 ℃ durante 10 min, retirar la capa superior, llevar la fase orgánica inferior a botella seca (transparente sin impurezas), secar con nitrógeno o aire completamente por evaporación rotatoria a 50 ℃

5) Disolver los residuos secos en 1 mL de la solución redisoludora diluida, agregar 1 mL de N-hexano, mezclar durante 30 segundos;Centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 5 min.

6) Absorba ligeramente las impurezas blancas de las capas superior y media, tome 100 µl de la fase inferior, agregue 100 µl de solución redisoludora diluida y mezcle durante 30 segundos.

7) Tome 50 µl de solución para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:2

5.3Miel

• Pesar 2,0 ± 0,05 g de muestra de miel en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 8 ml de acetonitrilo (CH₃CN) - Solución de mezcla de cloruro de metileno - HCl 0,1 M, agitar completamente durante 3 minutos, centrifugar a más de 4000 r/min a 15 ℃ durante 10 minutos.
• Tome 2 ml del sobrenadante (capa superior), seque con nitrógeno o aire a 56 ℃.
• Agregue 1 ml de la solución redisolunte diluida, agite completamente durante 1 minuto.
• Tome 50 µL para su posterior análisis.

Pliegue de dilución de la muestra:2

6. Procedimientos ELISA

6.1 Instrucciones

• Lleve todos los reactivos y las tiras de micropocillos a temperatura ambiente (20-25 ℃) antes de su uso;
• Devuelva todos los reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso;
• La reproducibilidad del análisis ELISA depende en gran medida de la consistencia del lavado de la placa.El correcto funcionamiento del lavado de placas es el punto clave en los procedimientos de ELISA;
• Para la incubación a temperaturas constantes, todas las muestras y reactivos deben evitar la exposición a la luz y cada microplaca debe estar sellada con la membrana protectora.

6.2 Procedimientos de operación

• Saque todos los reactivos necesarios y colóquelos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos.Tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse para que se mezcle uniformemente antes de usarlo;
• Tome las tiras de micropocillos y los marcos de placas necesarios.Se volvió a sellar la microplaca no utilizada y se almacenó a 2-8 ℃;
• Preparación de la solución: diluya 40 ml de tampón de lavado concentrado 20X con agua desionizada a 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20X + 19 partes de agua desionizada), o prepárelo según la cantidad necesaria;
• Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar;cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado;registrar sus posiciones;
• Agregue 50 µL de la muestra o solución estándar para separar los pocillos duplicados, agregue 50 µL de conjugado enzimático y luego agregue 50 µL de la solución de trabajo del anticuerpo en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente, sellar la microplaca con la membrana de cobertura yincubar a los 25℃para30 minutos;
• Lavar la microplaca con el tampón de lavado a 250 µL/pocillo de cuatro a cinco veces. Remojar el pocillo con el tampón de lavado durante 15-30 segundos, agitar para secar con papel absorbente (si quedan burbujas después de agitar, cortarlas con las puntas limpias);
• Coloración: agregue 50 µL de la solución del sustrato A y 50 µL de la solución B en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente yincubar a los 25℃para15min en la oscuridad para darle color;
• Determinación: añadir 50 µL de solución de parada en cada pocillo.Mezclar agitando suavemente.Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD.(Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar los resultados;el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa.Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con el contenido de fluoroquinolona en la muestra.

7.1 Determinación cualitativa

El rango de concentración (ng/mL) se obtiene al comparar el valor de DO promedio de la muestra con el de la solución estándar.Suponiendo que el valor de DO de la muestraⅠ es 0,238 y el de la muestraⅡ es 0,946, el valor de DO de las soluciones estándar es: 1,845 para 0 ppb, 1,542 para 1 ppb, 1,130 para 3 ppb, 0,635 para 9 ppb, 0,326 para 27 ppb <0,156 para 81 ppb, en consecuencia, el rango de concentración de la muestraⅠ es de 27 a 81 ppb, y el de la muestraⅡ es de 3 a 9 ppb.(multiplicado por el pliegue de dilución correspondiente)

7.2 Determinación cuantitativa

El valor medio de los valores de absorbancia es equivalente al porcentaje del valor OD promedio (B) de la muestra y la solución estándar dividido por el valor OD (B₀) de la primera solución estándar (estándar 0) y posteriormente se multiplica por 100%, es decir,

B: el valor de DO promedio (pocillos dobles) de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

Dibuje la curva estándar con los porcentajes de absorción de las soluciones estándar y los valores de semilogaritmo de las soluciones estándar de fluoroquinolonas (ng/mL) como eje Y y X, respectivamente.Lea la concentración correspondiente de la muestra de la curva estándar incorporando su porcentaje de absorción en la curva estándar.Posteriormente el valor resultante se multiplica por el factor de dilución correspondiente, obteniendo finalmente la concentración de Fluoroquinolona en la muestra.

Usar el software de análisis profesional de este kit será más conveniente para el análisis rápido y preciso de una gran cantidad de muestras.(Por favor contáctenos para este software)

8. Precauciones

• La temperatura ambiente inferior a 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.
• La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada;Continúe con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.
• Mezcle uniformemente, de lo contrario habrá una reproducibilidad no deseada.
• La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel.
• No utilice el kit superando su fecha de caducidad.El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO.No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote a utilizar.
• Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla.La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.
• Desechar la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución.El valor de detección de la solución estándar 0 inferior a 0,5 (A450 nm< 0,5) indica su degeneración.

8. La temperatura de reacción óptima es 25 ℃, y temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad.

Almacenamiento:almacenar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad:1 año;la fecha de producción está en la caja.

Nota: Si el paquete al vacío de la microplaca tiene fugas, su uso aún es válido, no afecta el resultado de la prueba, no dude en usarlo.