Kit de ensayo ELISA de ocratoxina A Tiempo de incubación corto 15 min-5 min para piensos para granos

Kit de prueba ELISA de ocratoxina A

N.º de catálogo LSY-10034B

1. Principio

Este kit de prueba se basa en el inmunoensayo enzimático competitivo indirecto para la detección de ocratoxina A. El antígeno de acoplamiento está recubierto previamente en las tiras de los micropocillos. La ocratoxina A de la muestra y los antígenos de acoplamiento recubiertos previamente en las franjas de los micropocillos compiten por los anticuerpos anti-ocratoxina A. Después de la adición del conjugado enzimático, se agrega el sustrato TMB para la coloración. El valor de densidad óptica (OD) de la muestra tiene una correlación negativa con la ocratoxina A en la muestra. Este valor se compara con la curva estándar y posteriormente se obtienen los residuos de Ocratoxina A.

2. Especificaciones técnicas

Sensibilidad: 0,1 ppb

Temperatura de la incubadora: 25 ℃

Tiempo de incubadora: 15min~5 minutos

Límite de detección:

Piensos, cereales…………………….................................................………….4ppb

Tasa de reacción cruzada:

Ocratoxina A…................................................................................ ….100%

Tasa de recuperación:

Piensos, cereales………………………………………………………………95±25%

3. Componentes

4. Materiales necesarios pero no proporcionados

1) Equipo:Lector ELISA (450 nm/630 nm), homogeneizador, agitador, centrífuga, balanza: 0,01 g sensible a la cantidad, incubadora, pipetas graduadas, impresora

2) Micropipetas:monocanal 20 ml ~ 200 ml, 100 ml ~ 1000 ml, multicanal 30 ~ 300 μl

3) Reactivos:Metanol.

5. Pretratamiento de muestra

Instrucciones(Los siguientes puntos deben abordarse antes del pretratamiento)

1. Sólo se pueden usar puntas desechables para los experimentos y las puntas deben cambiarse cuando se usan para absorber diferentes reactivos;

2) Antes del experimento, cada utensilio experimental debe estar limpio y debe volver a limpiarse si es necesario, para evitar contaminación que interfiera con los resultados experimentales.

Preparación de la solución antes del pretratamiento de la muestra:

1) muestrasolución redisolutiva

Utilice 1 parte de solución redisoludora concentrada 2X y disuelva con 1 parte de agua desionizada para obtener la solución redisoludora de muestra lista para usar.

2) Solución de extracto de muestra

Utilice 7 partes de metanol y disuélvalo con 3 partes de agua desionizada para obtener la solución de extracto de muestra lista para usar.

Preparación de muestras

1. Preparación de pienso, muestra de grano.

1. Tome 5,0 ± 0,05 g de muestra homogeneizada en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregue 25 ml.Solución de extracto de muestra, oscilación de vórtice durante 3 min, centrifugar a más de 4000 r/min a temperatura ambiente durante 5 min;
2. Tome 100 ul de sobrenadante en un tubo de centrífuga nuevo, agregue 700 ul de solución de redisolución de muestra, agite durante 1 minuto para que quede uniformemente;
3. Tome 50μl para probar

Factor de dilución: 40

6. Procedimientos ELISA

6.1 Instrucciones

1. Deje que los reactivos ELISA alcancen la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de su uso.

2. Vuelva a colocar los reactivos ELISA a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso.

3. La reproducibilidad de ELISA en el proceso de análisis depende en gran medida de la consistencia de la placa de lavado, el funcionamiento correcto de la placa de lavado es el punto de determinación del programa ELISA.

4. En todo proceso de incubación a temperatura constante, evite la exposición a la luz, selle la microplaca con la membrana protectora.

6. 2Procedimientos de operación

1. Lleve el kit de prueba a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante al menos 30 minutos; tenga en cuenta que cada reactivo debe agitarse uniformemente antes de usarlo;

2. Coloque las tiras de micropocillos necesarias en los marcos de placas. Se volvió a sellar la microplaca no utilizada, se almacenó a 2-8 ℃, no se congeló.

3. Preparación de la solución: tome 40 ml de tampón de lavado concentrado 20X, disuélvalos con agua desionizada a razón de 1:19 (1 parte de tampón de lavado concentrado 20X + 19 partes de agua desionizada) o prepárelo según la cantidad necesaria.

4. Numeración: numerar los micropocillos según las muestras y la solución estándar; cada muestra y solución estándar debe realizarse por duplicado; registrar sus posiciones.

5. Agregue estándar/muestra: agregue 50 µL de la muestra o la solución estándar en pocillos duplicados separados, luego agregue el conjugado enzimático, 50 µL/pocillo; luego solución de trabajo de anticuerpos, 50 l/pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente, sellar la microplaca con la membrana de cobertura,incubar a los 25°Cdurante 15 min en la oscuridad.

6. Lave la microplaca: abra con cuidado la tapa y vierta el líquido del micropocillo; agregue 250 µL/pocillo de tampón de lavado, lave completamente 4-5 veces, 15-30 s cada vez, luego saque y agite para secar con papel absorbente. (Use una lanza sin usar para perforar la burbuja después del secado).

7. Coloración: primero agregue 50 µL de solución de sustrato A y luego 50 µL de solución de sustrato B en cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente yincubar a los 25°Cdurante 5 minutos en la oscuridad para colorear.

8. Determinación: añadir 50 µL de la solución de parada en cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente. Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm para determinar el valor de OD de cada pocillo. (Se recomienda leer el valor de OD en la longitud de onda dual 450/630 nm en 5 minutos).

7. Juicio de resultados

Hay dos métodos para juzgar los resultados; el primero es el juicio aproximado, mientras que el segundo es la determinación cuantitativa. Tenga en cuenta que el valor de DO de la muestra tiene una correlación negativa con la ocratoxina A en la muestra.

7.1 determinación cualitativa

El rango de concentración (ppb) se puede obtener comparando el valor de absorbancia promedio con los estándares. Supongamos que el valor de absorbancia de la muestra uno es 0,3, la muestra dos es 1,0 y los estándares son: 0 ppb de 1,953; 0,1 ppb de 1,585; 0,3 ppb de 1,256; 0,9 ppb de 0,626; 2,7 ppb de 0,253. Entonces, la concentración de la muestra está en el rango de 0,9 ppb ~ 2,7 ppb; La muestra dos es de 0,3 ppb ~ 0,9 ppb. El rango de concentración de ocratoxina A en las muestras se puede obtener multiplicando por la dilución correspondiente de la muestra.

7.2 Análisis cuantitativo

Para calcular la concentración de las muestras se debe realizar una curva estándar. Antes de realizar la curva estándar, se debe conocer el concepto de % de absorbancia.

Cálculo del % de absorbancia:

B: el valor OD promedio de la muestra o la solución estándar

B₀—el valor promedio de DO de la solución estándar de 0 ng/mL

De este modo, el estándar cero se iguala al 100 % y los valores de absorbancia se expresan en porcentajes. Los valores calculados para los estándares se introducen en un sistema de coordenadas en papel cuadriculado semilogarítmico frente a la concentración de ocratoxina A [ng/ml]. La concentración de ocratoxina A en ng/ml (ppb) correspondiente a la absorbancia de cada muestra se puede leer en la curva de calibración.

Un software especial para el análisis de resultados de ELISA facilitará determinaciones dobles o múltiples. Si lo necesita, llame para solicitarlo.

8. Precauciones

1. La temperatura ambiente por debajo de 25 ℃ o la temperatura de los reactivos y las muestras que no se devuelven a la temperatura ambiente (20-25 ℃) darán lugar a un valor de DO estándar más bajo.

2. La sequedad de la microplaca en el proceso de lavado estará acompañada de situaciones que incluyen curvas estándar no lineales y reproducibilidad no deseada; Continúe con el siguiente paso inmediatamente después del lavado.

3. Mezcle uniformemente antes de agregar cualquier reactivo.

4. La solución de parada es la solución de ácido sulfúrico 2 M, evite el contacto con la piel.

5. No utilice el kit superando su fecha de caducidad. El uso de reactivos diluidos o adulterados de los kits provocará cambios en la sensibilidad y los valores de detección de DO. No intercambie los reactivos de los kits de diferentes números de lote a utilizar.

6. Almacenamiento: almacenar a 2-8 ℃, no congelado. Coloque la microplaca no utilizada en una bolsa con cierre automático para volver a sellarla. La sustancia estándar y el formador de color incoloro son sensibles a la luz y, por lo tanto, no pueden exponerse directamente a la luz.

7. Deseche la solución de coloración con cualquier color que indique la degeneración de esta solución. El valor de detección (450/630 nm) de la solución estándar 0 (0 ppb) inferior a 0,5 ((A450 nm <0,5)) indica su degeneración.

8. La temperatura de reacción óptima es 25 ℃, y temperaturas demasiado altas o demasiado bajas provocarán cambios en la sensibilidad de detección y los valores de OD.

9. Almacenamiento y fecha de caducidad.

Almacenamiento: conservar a 2-8 ℃, no congelado.

Fecha de caducidad: 12 meses; la fecha de producción está en la caja.

Nota: Si el paquete al vacío de la microplaca tiene fugas, su uso aún es válido, no afecta el resultado de la prueba, no dude en usarlo.

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